تکنیک استخراج RNA: یک راهنمای جامع برای متخصصان آزمایشگاهی

استخراج RNA یکی از مهم‌ترین تکنیک‌ها در بیولوژی مولکولی است که برای مطالعه ژن‌ها و عملکردهای آن‌ها ضروری است. با توجه به کاربردهای گسترده این تکنیک در تحقیقات ژنتیک، بیوتکنولوژی، و پزشکی، درک اصول و مراحل آن برای متخصصان آزمایشگاهی از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. در این مقاله، به بررسی گام‌به‌گام فرآیند استخراج و خالص‌سازی RNA می‌پردازیم و نکات کاربردی برای دستیابی به نتایج بهینه را ارائه می‌دهیم.

استخراج RNA چیست؟

RNA (ریبونوکلئیک اسید) یکی از مولکول‌های کلیدی در انتقال اطلاعات ژنتیکی و تنظیم بیان ژن‌ها است. تکنیک استخراج RNA فرآیندی است که برای جداسازی RNA از سلول‌ها و بافت‌ها به کار می‌رود. این فرآیند پایه بسیاری از تکنیک‌های پیشرفته مانند RT-PCR، RNA-Seq و microarray است.

اهداف استخراج RNA

• تحقیقات گسترده برو روی بیان ژن‌ها
• تحقیقات برای فهم مکانیسم بسیاری از بیماری ها
• توسعه بیومارکر برای تشخیص بیماری ها
• تولید دارو و پروتئین های نوترکیب

انواع RNA که در آزمایش‌ها استخراج می‌شوند

• mRNA (RNA پیام‌رسان): برای مطالعه بیان ژن.
• rRNA (RNA ریبوزومی): برای بررسی عملکرد ریبوزوم‌ها.
• tRNA (RNA انتقال‌دهنده): مرتبط با انتقال آمینواسیدها. چرا RNA استخراج میکنیم ؟
• miRNA or microRNA or miR
• LncRNA or Long non_coding RNA
• cfRNA
• ExoRNA or EV_RNA
• Total RNA
  

استخراج RNA از کجا انجام می‌گیرد؟

سلول های کشت شده در محیط کشت (جانوری،باکتریایی،قارچی،گیاهی)

بافت های جداشده از بدن (بافت توموری درمقابل بافت سالم، بافت ملتهب، بافت ترمیم شده)

نمونه خون کامل

سرم

پلاسما

ادرار ، مایع CSF ،مایعات جنسی ، ترشحات عفونی، اشک ، بزاق و…

اگزوزوم ها یا وزیکولهای خارج سلولی

💡انواع روش‌های استخراج RNA :

1️⃣ روش کروماتوگرافی
(chromatography)

2️⃣ روش فنول کلروفرم یا روش رسوب الکلی 👈🏻 روش آلی
(Alcohol precipitation)

3️⃣ روش ستونی و اتصال به سیلیکا
(Silica matrices)

4️⃣ روش مگنتیک (magnetic beads)

✅️ روش فنول کلروفرم گوانیدین :

1️⃣ فنول باعث دگرده شدن پروتئین ها

2️⃣ کلروفرم باعث بهبود فرآیند عمل فنول شده و همچنین از برگشت فنول به فاز آبی جلوگیری می‌کند.

3️⃣ کلروفرم باعث دناتوره شدن لیپید ها نیز می‌شود.

✔️ در استخراج DNA از فنول با PH بالا (۷_۸) استفاده می‌شود.

✔️ در استخراج RNA از فنول با PH پایین استفاده می‌شود.

✔️ از گوانیدین ایزوتیوسیانات به عنوان نمک کاتروپیک استفاده میشود‌.

مراحل اصلی استخراج RNA

۱. آماده‌سازی نمونه

• نمونه‌های بافتی یا سلولی باید تازه باشند یا با استفاده از مواد نگهدارنده مانند RNAlater تثبیت شوند.
• برای به حداقل رساندن تجزیه RNA، از دمای پایین (مانند نیتروژن مایع) استفاده کنید.

۲. لیز سلولی

• استفاده از بافرهای تخریبی برای شکستن غشاهای سلولی و آزادسازی RNA.
• در این مرحله، آنزیم‌های RNase باید غیر فعال شوند تا از تخریب RNA جلوگیری شود.

۳. جداسازی RNA

• روش‌های شیمیایی: استفاده از فنل-کلروفرم (روش Trizol).
• روش‌های ستونی: کیت‌های خالص‌سازی تجاری.

۴. خالص‌سازی RNA

برای حذف آلودگی‌های DNA و پروتئین‌ها، از آنزیم DNase و روش‌های خالص‌سازی بیشتر استفاده می‌شود.

چالش‌های رایج در استخراج RNA

1. تجزیه RNA: RNA مولکولی ناپایدار است و به سرعت توسط RNaseها تخریب می‌شود.
2. آلودگی با DNA: حضور DNA در نمونه می‌تواند نتایج را مخدوش کند.
3. کیفیت پایین نمونه‌ها: استفاده از نمونه‌های کهنه یا آلوده می‌تواند بازده را کاهش دهد.

نکات کاربردی برای غلبه بر این چالش‌ها

• همیشه از ابزار و محیط‌های تمیز استفاده کنید.
• مواد مصرفی مخصوص RNA (RNase-free) تهیه کنید.
• از RNase Inhibitorها استفاده کنید.

روش‌های پیشرفته برای خالص‌سازی RNA

استخراج RNA با کیت‌های تجاری

کیت‌های آماده مانند Qiagen RNeasy و Zymo Research Direct-zol، فرآیند استخراج RNA را ساده‌تر و کارآمدتر می‌کنند. این کیت‌ها با استفاده از فیلترهای ستونی، خالص‌سازی دقیق‌تری ارائه می‌دهند.

روش مغناطیسی

این روش با استفاده از ذرات مغناطیسی امکان استخراج سریع و خالص‌سازی RNA را فراهم می‌کند و برای آزمایش‌های با بازده بالا مناسب است.

کاربردهای استخراج RNA

• تحلیل بیان ژن: با تکنیک‌هایی مانند RT-qPCR و RNA-Seq.
• توسعه دارو: بررسی اثرات داروها بر بیان ژن‌ها.
• تشخیص بیماری‌ها: استفاده از RNA به‌عنوان بیومارکر برای تشخیص بیماری‌های مختلف مانند سرطان.

سوالات متداول درباره تکنیک استخراج RNA

۱. چرا RNA به سرعت تجزیه می‌شود؟

RNA به دلیل ساختار ناپایدار و حضور RNaseها به راحتی تجزیه می‌شود. برای جلوگیری از این مشکل، محیط کار باید عاری از RNase باشد.

۲. چگونه می‌توان کیفیت RNA استخراج شده را بررسی کرد؟

کیفیت RNA را می‌توان با دستگاه نانودراپ و الکتروفورز ژل آگارز بررسی کرد. نسبت OD260/OD280 باید حدود ۲ باشد.

۳. آیا می‌توان RNA از نمونه‌های قدیمی استخراج کرد؟

بله، اما کیفیت و بازده آن ممکن است پایین باشد. استفاده از مواد نگهدارنده مانند RNAlater توصیه می‌شود.

۴. تفاوت بین روش‌های ستونی و شیمیایی در چیست؟

روش‌های ستونی سریع‌تر و آسان‌تر هستند، اما روش‌های شیمیایی (مانند فنل-کلروفرم) برای نمونه‌های پیچیده کارایی بهتری دارند.

۵. چه عواملی باعث کاهش بازده RNA می‌شود؟

آلودگی با RNase، کیفیت پایین نمونه و استفاده از مواد مصرفی نامناسب از عوامل اصلی کاهش بازده هستند.