وسترن بلات Western Blot چیست؟

وسترن بلات (Western blot) که با نام ایمونوبلات (Immunoblot) نیز شناخته می‌شود، یک تکنیک پرکاربرد برای تجزیه و تحلیل کیفی و کمی پروتئین‌ها در یک نمونه آزمایشی است. به بیان ساده، وسترن بلات به شما می‌گوید که آیا پروتئین مدنظر شما در یک نمونه وجود دارد یا خیر، و اینکه فراوانی نسبی آن چقدر است.

این تکنیک شامل جداسازی پروتئین‌های نمونه آزمایشی از طریق الکتروفورز ژل، انتقال پروتئین‌های جداشده از ژل به یک غشا (Membrane)، و سپس تشخیص پروتئین هدف روی غشا با استفاده از آنتی‌بادی‌هایی است که به عنوان کاوشگرهای مولکولی (Molecular probes) عمل می‌کنند. در نهایت، غشا با استفاده از معرف‌های تشخیصی ظاهر می‌شود تا بتوان نتایج را به‌صورت بصری تحلیل کرد.

نام بلات (به معنای لکه‌گذاری یا جذب کردن) از فرآیند انتقال پروتئین‌ها از ژل به غشا گرفته شده است؛ درست مانند زمانی که آبمیوه ریخته‌شده روی میز غذاخوری را با یک دستمال کاغذی جذب کرده و پاک می‌کنید.

مراحل اساسی یک آزمایش وسترن بلات عبارتند از:

1. استخراج پروتئین‌ها از نمونه‌های آزمایشی (بافت گیاهی/جانوری، رده سلولی یا کشت میکروبی).
2. الکتروفورز نمونه پروتئینی.
3. انتقال پروتئین‌ها از ژل به یک غشا.
4. تشخیص پروتئین هدف روی غشا با استفاده از یک یا چند آنتی‌بادی.
5. ظاهر کردن (Developing) بلات تشکیل‌شده روی غشا برای تحلیل بصری نتایج.

بدون شک، تجزیه و تحلیل پروتئین‌ها یکی از ارکان اصلی علوم زیستی مدرن است و وسترن بلات نقش بسیار بزرگی در تحقیقات بیوشیمی پروتئین ایفا می‌کند. در این مقاله، مفاهیم تئوری نهفته در هر مرحله از وسترن بلات و همچنین برخی از انواع مختلف آن را بررسی خواهیم کرد.

چرا به آن «وسترن بلات» می‌گویند؟

وسترن بلات نام خود را از یک تکنیک قدیمی‌تر به نام سادرن بلات Southern blot که برای آنالیز DNA استفاده می‌شود وام گرفته است. سادرن بلات به افتخار کاشف آن، ادوین سادرن Edwin Southern) نام‌گذاری شد.

از آن زمان به بعد، برای حفظ هماهنگی در نام‌گذاری تکنیک‌های بلاتینگ، سایر روش‌های توسعه‌یافته نیز بر اساس جهات جغرافیایی نام‌گذاری شدند: نورترن بلات Northern blot برای RNA و وسترن بلات برای آنالیز پروتئین.

آماده‌سازی نمونه برای وسترن بلات

نمونه‌های مورد استفاده در وسترن بلات ممکن است از بافت گیاهی یا جانوری به دست آیند؛ مثلاً برای بررسی اینکه آیا یک پروتئین خاص در برگ اسفناج تراریخته یا در گوش موش بیان می‌شود یا خیر. همچنین، نمونه‌ها می‌توانند از یک سلول یا کشت میکروبی تهیه شوند.

نمونه‌ها حتی می‌توانند بالینی باشند. به عنوان مثال، یک دانشمند علوم بالینی ممکن است بخواهد بداند که آیا پروتئین خاصی در خون یک بیمار یا در یک تومور خارج‌شده وجود دارد یا خیر.

برای آنالیز وسترن بلات، پروتئین‌های موجود در نمونه در بیشتر آزمایش‌ها با استفاده از حرارت، دترجنت سدیم دودسیل سولفات (SDS) و عوامل کاهنده‌ای مانند بتا-مرکاپتواتانول (BME) یا دی‌تیوتریتول (DTT)، تا سطح ساختار اولیه خود Denature می‌شوند.

با این حال، بسیار مهم است که زنجیره پلی‌پپتیدی تمامی پروتئین‌های موجود در نمونه‌ها سالم مانده و از تجزیه شدن در امان بمانند. اگر زنجیره پلی‌پپتیدی بشکند یا کوتاه شود، نتایج وسترن بلات اشتباه خواهد بود.

به همین دلیل، در مراحل استخراج و جداسازی پروتئین، باید دقت زیادی به خرج داد تا پلی‌پپتیدها توسط پروتئازها (Proteases) تجزیه نشوند. پروتئازها آنزیم‌هایی هستند که پروتئین‌ها را تجزیه می‌کنند.

پروتئازها ممکن است از ابتدا در نمونه شما وجود داشته باشند (مثلاً اگر نمونه شما از یک بافت زنده باشد). همچنین ممکن است از طریق آلودگی تصادفی وارد نمونه شوند؛ مثلاً اگر در حین استخراج پروتئین در حال صحبت با همکار خود باشید، قطرات ریز بزاق شما که حاوی پروتئاز است ممکن است وارد نمونه شده و پلی‌پپتیدها را تخریب کند.

برای جلوگیری از این اتفاق (که به آن پروتئولیز ناخواسته با واسطه پروتئاز می‌گویند)، در طول استخراج پروتئین از مهارکننده‌های پروتئاز (Protease inhibitors) استفاده می‌شود.

الکتروفورز ژل پروتئین

پس از آماده‌سازی نمونه، مرحله دوم الکتروفورز کردن نمونه‌ها در یک ژل است. هدف از الکتروفورز، جدا کردن پروتئین هدف از سایر پروتئین‌های موجود در نمونه است تا بتوانید آن را به درستی تشخیص دهید.

در این تصویر چهار چاهک (لاین) در حال بارگذاری هستند. یکی از آن‌ها لدر یا نشانگر پروتئینی Protein ladder است. فرض کنید نمونه‌های موجود در لوله‌های ۱، ۲ و ۳، پروتئین‌های استخراج‌شده از سه سویه جهش‌یافته (موتانت) ژنتیکی مختلف از یک باکتری هستند. لوله ۴ به عنوان نمونه کنترل در نظر گرفته می‌شود؛ یعنی حاوی پروتئین‌های استخراج‌شده از سویه آزمایشگاهی همان باکتری است که این ۳ جهش (نمونه‌های ۱ تا ۳) در آن ایجاد شده‌اند. شما می‌خواهید بررسی کنید که بیان یک پروتئین توکسین (سم) خاص در اثر این جهش‌ها، در مقایسه با سویه غیرجهش‌یافته، به چه شکلی تغییر کرده یا چگونه بیان می‌شود.

از آنجایی که اساس جداسازی در بیشتر آزمایش‌های وسترن بلات وزن مولکولی است، رایج‌ترین روش الکتروفورز در این تکنیک، SDS-PAGE است. این روش شامل واسرشت کردن پروتئین‌ها تا ساختار اولیه‌شان است و تمامی ساختارهای بالاتر پروتئین از بین می‌روند. اگر هدف حفظ تعاملات پروتئین-پروتئین باشد، از روش‌های غیر دناتوراسیون مانند Native PAGE استفاده می‌شود.

جهت شرکت در دوره پیشرفته SDS-PAGE اینجا کلیک کنید.

در بیشتر ایمونوبلات‌ها، لدر یا نشانگرهای پروتئینی (Protein ladders) نیز در یکی از چاهک‌ها بارگذاری می‌شوند. پس از الکتروفورز، باندهای لدر (نشانگر) قابل مشاهده هستند اما هیچ‌یک از پروتئین‌های واقعی نمونه هنوز دیده نمی‌شوند.

«همان‌طور که در شکل زیر در ادامه نشان داده شده است، پس از انجام الکتروفورز، ژل معمولاً به این شکل دیده می‌شود. باندهای نشانگر (لدر) قابل مشاهده هستند، اما هیچ‌یک از پروتئین‌های واقعی موجود در نمونه هنوز دیده نمی‌شوند.

مزایای استفاده از نشانگر پروتئینی رنگی (Ladder):

• تایید بصری: به شما کمک می‌کند تا به صورت چشمی تایید کنید پروتئین‌های شما چقدر در ژل حرکت کرده‌اند و تخمینی از میزان جداسازی پروتئین‌ها با وزن‌های مولکولی مختلف به دست می‌دهد.
• بررسی راندمان انتقال: پس از مرحله انتقال، باندهای رنگی نشانگر به شما کمک می‌کنند تا کارایی انتقال پروتئین از ژل به غشا را ارزیابی کنید.

انتقال پروتئین‌ها از ژل به غشا (Transfer)

پس از الکتروفورز، مرحله بعدی در ایمونوبلات، انتقال پروتئین‌ها از ژل به یک غشا است. پس از انتقال به غشا، پروتئین‌های الکتروفورزشده برای تشخیص و تجزیه‌وتحلیل‌های بیشتر تثبیت (Immobilized) می‌شوند. در اینجا یک تشبیه برای کمک به درک بهتر مرحله بلاتینگ (انتقال) آورده شده است: به یک دستمال کاغذی فکر کنید که برای کشیدن، جذب کردن یا «پاک کردن» مایع ریخته‌شده (مثلاً آب پرتقال) از روی میز غذاخوری استفاده می‌شود. به همین شکل، پروتئین‌ها نیز از ژل الکتروفورزشده روی غشای وسترن بلات منتقل (بلات) می‌شوند. ژل مشابه میز غذاخوری شماست، مایع ریخته‌شده شبیه به نمونه‌های پروتئینی است و دستمال کاغذی همان غشا می‌باشد.

اگر نمونه پروتئینی مستقیماً و بدون انجام الکتروفورز روی غشا بلات شود، به آن یکی از انواع وسترن بلات به نام دات بلات (Dot blot) می‌گویند. در این روش، نمونه برخلاف باندهای جداشده در ژل الکتروفورز، شبیه به یک نقطه (دات) روی غشا لکه‌گذاری می‌شود.

دات بلات در واقع یک نسخه سریع از وسترن بلات است که فقط برای بررسی این موضوع استفاده می‌شود که آیا پروتئین هدف شما واقعاً در نمونه وجود دارد یا خیر. در صورت مثبت بودن نتیجه، معمولاً یک فرآیند کامل وسترن بلات برای تجزیه‌وتحلیل دقیق‌تر روی نمونه انجام می‌گیرد.

اصول اولیه انتقال

تمامی نمونه‌های پروتئینی به دلیل پیش‌تیمار با SDS دارای بار منفی هستند. بنابراین، در حضور جریان الکتریکی، پروتئین‌ها به سمت قطب مثبت حرکت می‌کنند.

اصول اولیه انتقال: پروتئین‌های دارای بار منفی از ژل (که در سمت الکترود منفی (-) قرار دارد) به سمت غشا (که در سمت الکترود مثبت (+) قرار دارد) حرکت می‌کنند.

ژل مستقیماً روی غشا قرار داده می‌شود. نکته مهم این است که ژل در سمت الکترود منفی، و غشا در مجاورت الکترود مثبت قرار می‌گیرد. کاغذهای صافی (Filter papers) نیز بین الکترود مثبت و غشا، و همچنین بین ژل و الکترود منفی قرار داده می‌شوند.

از آنجا که کل فرآیند انتقال به عبور جریان الکتریکی وابسته است، تمام مجموعه انتقال در یک بافر انتقال (Transfer buffer) مرطوب می‌شود. بافر انتقال عبور آسان جریان الکتریکی را تضمین می‌کند و در طی این فرآیند، پروتئین‌ها از ژل به غشا منتقل می‌شوند.

نکته‌ای درباره غشاهای ایمونوبلات

غشاها از نظر شیمیایی طوری طراحی شده‌اند که میل ترکیبی (Affinity) بالایی به پروتئین‌ها داشته باشند. این ویژگی تضمین می‌کند که وقتی پروتئین‌ها به غشا می‌رسند، برای همیشه روی آن تثبیت شوند. غشاهای وسترن بلات معمولاً از جنس نیتروسلولز (Nitrocellulose) یا PVDF هستند. غشاهای PVDF مقاوم‌تر بوده و قابلیت استفاده مجدد دارند، اما گران‌تر هستند.

در ادامه، ترجمه دقیق و روان این متن ارائه شده است:

مراحل انتقال در وسترن بلات

اکنون که اصول اولیه انتقال را درک کردیم، در اینجا مراحل انتقال در وسترن بلات آورده شده است:

مرحله ۱: پردازش ژل پس از الکتروفورز. این مورد در شکل زیر نشان داده شده است.

پردازش ژل پس از الکتروفورز شامل برش و دور انداختن بخش بالایی ژل یعنی ژل متراکم‌کننده (Stacking gel) است. ژل استکینگ پس از پایان الکتروفورز، حاوی هیچ نمونه پروتئینی یا نشانگر (لدر) نیست.

سپس ژل جداکننده (Resolving gel) با احتیاط درون یک سینی حاوی بافر انتقال (Transfer buffer) قرار داده می‌شود. در این مرحله باید از سه مورد اطمینان حاصل کرد:

• ژل مرطوب بماند و خشک نشود.
• ژل در بافر انتقال به تعادل برسد (سازگار و هم‌دما شود). لطفاً توجه داشته باشید که ترکیب یونی بافر الکتروفورز (Running buffer) با بافر انتقال متفاوت است. بنابراین، برای انجام یک انتقال مناسب، بافر انتقال باید حتی در داخل بافت ژل نیز جایگزین بافر الکتروفورز شود.
• هیچ‌چیز، از جمله دستان شما که ممکن است دارای پروتئین باشند، نباید ژل را آلوده کند.

مرحله ۲: آماده‌سازی غشا برای راه‌اندازی فرآیند انتقال. شکل زیر این مرحله را نشان می‌دهد.

غشا معمولاً در حالی که بین دو ورقه پوششی (که به رنگ آبی روشن نشان داده شده) پیچیده شده است، عرضه می‌شود. غشا متناسب با اندازه ژل برش داده می‌شود، با استفاده از یک پنس از بین پوشش کاغذی دولایه خارج شده و برای رسیدن به تعادل، در یک سینی حاوی بافر انتقال قرار می‌گیرد.

کاغذهای صافی (Filter papers) نیز به همین ترتیب برش داده شده و در بافر انتقال به تعادل می‌رسند.

همانند ژل، برای جلوگیری از بروز هرگونه آلودگی پروتئینی، غشا نیز نباید با دست برهنه لمس شود.

مرحله ۳: ساخت ساندویچ انتقال. این مرحله همان‌طور که در شکل قبلی نشان داده شده است، انجام می‌شود.

پس از انتقال، غشا معمولاً شبیه به چیزی است که در شکل زیر نشان داده شده است.

در این حالت، چاهک مربوط به نشانگر (لدر) نمایان می‌شود، اما نمونه‌های پروتئینی واقعی که روی غشا منتقل شده‌اند، هنوز قابل مشاهده نیستند.

انتقال نیمه‌خشک (Semi-dry) در برابر انتقال مرطوب (Wet)

دو روش برای انتقال وجود دارد: مرطوب (Wet) و نیمه‌خشک (Semi-dry).

در انتقال مرطوب، ساندویچ انتقال درون مخزنی پر از بافر انتقال قرار می‌گیرد. این مخزن انتقال دارای دو الکترود است که جریان الکتریکی از طریق آن‌ها عبور می‌کند. همان‌طور که در شکل ۸ نشان داده شده است، ساندویچ بین دو اسفنج قرار می‌گیرد. چیدمان به این ترتیب است: اسفنج، کاغذهای صافی، ژل، غشا، کاغذهای صافی، اسفنج – که دقیقاً با همین ترتیب درون یک کاست (Cassette) قرار می‌گیرند. این کاست سپس داخل مخزن بافر قرار داده می‌شود.

در روش نیمه‌خشک، ساندویچ انتقال شامل کاغذهای صافی >> ژل >> غشا >> کاغذهای صافی که در بافر انتقال مرطوب شده است، مستقیماً بین الکترودها قرار می‌گیرد. ساندویچ در این حالت مرطوب است، اما برخلاف روش مخزن (انتقال مرطوب)، در بافر انتقال غوطه‌ور نمی‌شود.

معماری انتقال نیمه‌خشک را می‌توانید مشابه فرآیند درست کردن یک ساندویچ فشرده در دستگاه ساندویچ‌ساز در نظر بگیرید. دو سطح دستگاه ساندویچ‌ساز همان الکترودهای مثبت و منفی شما هستند. ساندویچ انتقال نیز شبیه به ساندویچ شماست؛ کاغذهای صافی در دو طرف مانند برش‌های نان، ژل مانند ورقه کالباس و غشا مانند ورقه پنیر است. کل ساندویچ نیز به سس گوشت (البته منظورم همان بافر انتقال است) آغشته و مرطوب می‌شود.

انتقال مرطوب در انتقال پروتئین‌ها، به‌خصوص پروتئین‌های بزرگتر، کارآمدتر و موثرتر است. مخزن انتقال مرطوب حاوی مقدار زیادی بافر است که جریان الکتریکی یکنواخت و ثابتی را در طول کل فرآیند انتقال تضمین می‌کند. همچنین، با انجام فرآیند انتقال در یک اتاق سرد (Cold room)، می‌توان مخزن را خنک نگه داشت. این کار مشکلاتی را که به دلیل گرم شدن بافر و ساندویچ در حین انتقال (در اثر عبور جریان الکتریکی) به وجود می‌آیند، کاهش می‌دهد.

در روش نیمه‌خشک، احتمال خشک شدن یا داغ شدن بیش از حد ساندویچ در حین انتقال وجود دارد. به دلیل همین عوامل، روش مرطوب را به عنوان یک روش اصولی‌تر در نظر بگیرید؛ چیزی شبیه به «آرام‌پز کردن تا رسیدن به یک نتیجه بی‌نقص». از سوی دیگر، روش نیمه‌خشک ارزان‌تر است (زیرا به بافر انتقال بسیار کمتری نیاز دارد)، سریع‌تر انجام می‌شود و دردسرهای کمتری دارد.

فرآیند تشخیص Detection در وسترن بلات

پس از انتقال، نوبت به تشخیص پروتئین می‌رسد. این بخش شامل سه مرحله اصلی است:

۱. رنگ‌آمیزی کل پروتئین Total Protein Staining

استفاده از یک نشانگر پروتئینی رنگی (Ladder) تا حدودی به شما این امکان را می‌دهد که راندمان (کارایی) انتقال را ارزیابی کنید؛ به این صورت که هرچه شدت رنگ باندها بیشتر باشد، انتقال بهتر انجام شده است.

اما این موضوع ممکن است فقط در مورد چاهک (لاین) مربوط به نشانگر صدق کند. شما نمی‌دانید که نمونه‌های موجود در سایر چاهک‌ها با چه کیفیتی منتقل شده‌اند. اگر راندمان انتقال در بین چاهک‌های مختلف (Inter-lane) و یا در داخل یک چاهک (Intra-lane) متفاوت باشد، این امر می‌تواند به نتایج اشتباه و گمراه‌کننده‌ای منجر شود.

یک راهکار برای حل این مشکل، رنگ‌آمیزی کل غشا است.

رنگ‌آمیزی کل غشا عمدتاً برای دو هدف زیر انجام می‌شود:

• بررسی و ارزیابی راندمان انتقال
• در اختیار داشتن کنترل‌های بارگذاری (Loading controls)

هرچند بررسی دقیق این موضوع کمی خارج از حوصله این مقاله است، اما در اینجا یادداشت کوتاهی درباره «کنترل بارگذاری» در وسترن بلات آورده شده است:

کنترل بارگذاری به این معناست که شما شواهدی ارائه می‌دهید تا ثابت کنید مقدار برابری از کل پروتئین در هر چاهک بارگذاری شده است. این موضوع از آن جهت اهمیت دارد که ثابت می‌کند اگر پروتئین هدف شما با فراوانی متفاوتی در چاهک‌های مختلف (که حاوی نمونه‌های متفاوتی هستند) ظاهر شد، این تفاوت صرفاً ناشی از یک اثر بیولوژیکی است و نه به دلیل تفاوت در میزان نمونه بارگذاری‌شده.

پس از انجام این مرحله اختیاری (یعنی رنگ‌آمیزی کل پروتئین)، مراحل اصلی تشخیص را با مسدودسازی (Blocking) غشا آغاز می‌کنید.

۲. مسدودسازی یا بلاکینگ Blocking

قبل از اضافه کردن آنتی‌بادی‌ها، غشا با یک محلول پروتئینی مانند آلبومین سرم گاوی (BSA) یا شیر خشک بدون چربی «مسدود» می‌شود. این کار از اتصال غیرспеصسی (Non-specific binding) آنتی‌بادی‌ها به غشا جلوگیری کرده و نویز پس‌زمینه را کاهش می‌دهد (بهبود نسبت سیگنال به نویز).

آنتی‌بادی اولیه به دلیل میل ترکیبی (Affinity) اختصاصی و بسیار بالای خود، می‌تواند به پروتئین هدف (به رنگ آبی تیره) متصل شود. آنتی‌بادی اولیه قادر به اتصال به سایر پروتئین‌های غیرهدف نیست، زیرا محلول مسدودکننده جلوی تمام اتصالات غیراختصاصی آنتی‌بادی اولیه را می‌گیرد. این امر نسبت سیگنال به نویز (Signal-to-noise ratio) را در نتایج وسترن بلات بهبود می‌بخشد.

۳. کاوش Probing غشا با آنتی‌بادی‌ها

• آنتی‌بادی اولیه (Primary Antibody): به عنوان کاوشگر اصلی عمل کرده و مستقیماً به پروتئین هدف شما روی غشا متصل می‌شود.
• آنتی‌بادی ثانویه (Secondary Antibody): به عنوان کاوشگر ثانویه به آنتی‌بادی اولیه (که به پروتئین هدف چسبیده است) متصل می‌شود.

سنجش تشخیص نهایی: ظاهر کردن ایمونوبلات

پس از تیمار با آنتی‌بادی ثانویه، مرحله نهایی ظاهر کردن غشا برای تحلیل بصری است. بسته به نوع آنتی‌بادی ثانویه، روش تشخیص می‌تواند یکی از سه حالت زیر باشد:

1. فلورومتری (Fluorometric)
2. کمی‌لومینسانس (Chemiluminescent)
3. کروموژنیک یا رنگ‌زا (Chromogenic)

وسترن بلاتینگ (Western blotting) یک روش پرطرفدار برای شناسایی و مطالعه پروتئین‌هاست. با وجود محبوبیت آن، به دست آوردن نتایج تکرارپذیر و قابل اعتماد در هنگام انجام وسترن بلات همیشه کار آسانی نیست. در اینجا، ما نکات و ترفندهایی را برای کمک به بهینه‌سازی وسترن بلات شما ارائه می‌دهیم که شامل نکات مفیدی در زمینه آماده‌سازی نمونه پروتئین، پردازش بلات و تشخیص (Detection) است.

آیا بارگذاری نمونه در ژل برایتان مشکل است؟

• برای تجربه بهتر، از سرسمپلرهای مخصوص بارگذاری ژل (Gel loading tips) استفاده کنید. این سرسمپلرها نازک‌تر هستند و به شما اجازه می‌دهند نوک آن‌ها را عمیق‌تر وارد چاهک کنید تا از سرریز شدن نمونه جلوگیری شود.

انتقال پروتئین‌های با وزن مولکولی بالا مشکل است؟

• برای کمک به کشیده شدن پروتئین‌ها از ژل به روی غشا، 0.01 تا 0.05% دترجنت SDS به بافر انتقال اضافه کنید.

آیا بلات شما لکه‌دار است؟

• برای نتایج بهتر، سعی کنید بافر مسدودکننده (Blocking buffer) شیری خود را فیلتر کنید. پودر شیر خشک اغلب به طور کامل حل نمی‌شود و ذرات جامد شیر می‌توانند در تشخیص وسترن شما تداخل ایجاد کنند.

سیگنال وسترن تمیزی دریافت نمی‌کنید؟

• اگر به جای آنتی‌بادی اولیه خالص‌سازی شده از یک آنتی‌سرم (Antiserum) استفاده می‌کنید، ممکن است پس‌زمینه بالایی ایجاد شود. با استفاده از لیزاتی (Lysate) که حاوی پروتئین هدف شما نیست، آن را تمیز کنید. کافیست 100 میکرولیتر از لیزات فاقد هدف را به آنتی‌سرم خود اضافه کنید، تکان دهید و یک شبانه‌روز در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.

می‌خواهید چندین هدف را با کمی‌لومینسانس تشخیص دهید؟

• با انکوبه کردن بلات با 2 یا چند آنتی‌بادی اولیه، 2 یا چند هدف را روی یک بلات تشخیص دهید. این کار به شرطی جواب می‌دهد که وزن مولکولی اهداف متفاوت باشد و شرایط ژل برای جداسازی اهداف از یکدیگر بهینه شده باشد.

از آنتی‌بادی‌های اولیه خود بارها و بارها استفاده می‌کنید؟

• مطمئن شوید که یک عامل ضد میکروبی برای جلوگیری از رشد میکروب‌ها اضافه می‌کنید. سدیم آزید برای تشخیص با سیستم HRP توصیه نمی‌شود. از عوامل ضد میکروبی جایگزین مانند نگهدارنده‌های KATHON™ یا ProClin™ با غلظت‌های تا 0.1% استفاده کنید. از آنتی‌بادی‌های اولیه خود بیشتر از 3 بار استفاده نکنید.

باندهای غیراختصاصی وسترن شما را خراب کرده‌اند؟

• سعی کنید تا 0.05% دترجنت Tween 20، Triton X-100 یا NP-40 را در بافرهای شستشو و مسدودکننده خود استفاده کنید.

می‌خواهید نشانگرهای پروتئینی رنگ‌نشده PageRuler را در بلات کمی‌لومینسانس خود تشخیص دهید؟

• فقط 1 میکرولیتر کونژوگه Strep-Tactin به ازای هر 10 میلی‌لیتر از محلول انکوباسیون آنتی‌بادی ثانویه خود اضافه کنید. لدرهای پروتئینی رنگ‌نشده Thermo Scientific PageRuler شما روی فیلم اشعه ایکس یا با استفاده از تجهیزات تصویربرداری قابل تشخیص خواهند بود.

پپتیدها را در وسترن تشخیص می‌دهید؟

• برای تقویت اتصال پپتیدها به غشا، تا 20% متانول به بافر انتقال اضافه کنید. از یک غشای PVDF با منافذ 0.2 میکرومتر استفاده کنید تا از عبور و هدر رفتن پپتیدها جلوگیری شود.

مطمئن نیستید سوبسترای کمی‌لومینسانس شما کار می‌کند یا خیر؟

• یک تست سریع در تاریک‌خانه انجام دهید. در تاریکی، 1 میکرولیتر آنتی‌بادی ثانویه کونژوگه با HRP را به محلول کاری (Working solution) سوبسترای خود اضافه کنید. اگر درخشید، سوبسترای شما سالم و فعال است. در غیر این صورت، به سوبسترای جدید نیاز دارید.

در تشخیص پروتئین‌های کم‌تراکم مشکل دارید؟

• حساسیت را با سوبستراهای HRP با حساسیت بالا افزایش دهید یا سعی کنید شرایط بافر مسدودکننده فعلی را بهینه کنید. شیر بدون چربی 5% یک مسدودکننده قوی و انتخابی عالی برای پروتئین‌های فراوان یا در زمان وجود اتصال غیراختصاصی از سوی آنتی‌بادی‌های اولیه است. با این حال، به دلیل اینکه شیر 5% یک مسدودکننده قوی است، می‌تواند باعث مسدودسازی بیش از حد و سرکوب سیگنال شود.

حجم نمونه محدودی دارید؟

• با استفاده از سوبستراهای با حساسیت بالا مانند سوبسترای کمی‌لومینسانس ، مقادیر کمتری از نمونه خود را بارگذاری کنید. سوبستراهای با حساسیت بالا به شما امکان می‌دهند نمونه‌های خود را بیشتر بسط دهید و بارگذاری 1 میکروگرم یا کمتر در هر چاهک را برای دریافت سیگنال خوب امکان‌پذیر می‌سازند.

آنتی‌بادی محدودی دارید؟

• از سوبستراهای با حساسیت بالاتر نسبت به سوبستراهای استاندارد ECL استفاده کنید تا با غلظت‌های پایین‌تر آنتی‌بادی اولیه و ثانویه، سیگنال‌های قوی دریافت کنید.

بلات‌ها را استریپ می‌کنید اما نتیجه دلخواه را نمی‌گیرید؟

• همیشه بلات را به مدت 5 تا 10 دقیقه قبل از افزودن بافر استریپینگ با بافر شستشو خیس کنید. در صورت استفاده از بافر استریپینگ دست‌ساز (خانگی)، بلات را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تا 30 دقیقه حرارت دهید.

وسترن بلاتینگ فلورسنت

می‌خواهید از پس‌زمینه بالا جلوگیری کنید؟

• بافرهای نمونه (Sample buffers) حاوی بروموفنول بلو (Bromophenol blue) خاصیت فلورسانس دارند و می‌توانند باعث افزایش پس‌زمینه شوند. اگر از بافرهای نمونه حاوی این ماده استفاده می‌کنید، باید قبل از انتقال، رنگ خط مقدم (Dye front) را از ژل خارج کنید (برش دهید) یا پس از انتقال آن را از غشا ببرید تا از سیگنال فلورسانس پس‌زمینه جلوگیری شود.

می‌خواهید فلورسانس پس‌زمینه و نشت سیگنال به چاهک‌های مجاور را کاهش دهید؟

• مقدار نشانگرهای وزن مولکولی (لدر) بارگذاری‌شده روی ژل را کاهش دهید. از نشانگرهای تک‌رنگ و پیش‌رنگ‌آمیزی‌شده استفاده کنید، زیرا نشانگرهای چندرنگ ممکن است در کانال‌های نوری متفاوتی ظاهر شوند.

پس‌زمینه بالا به دلیل انتخاب نادرست غشا ایجاد شده است؟

• ماهیت غشا می‌تواند بر پس‌زمینه تأثیر بگذارد. غشاهایی با اتوفلورسانس پایین انتخاب کنید، از جمله نیتروسلولز و غشاهای تخصصی PVDF با فلورسانس پایین. همچنین، از نوشتن با خودکار روی غشاها خودداری کنید، زیرا بسیاری از جوهرها فلورسانس هستند؛ به جای آن از مداد استفاده کنید.

آیا آلودگی غشا یک مشکل است؟

• غشاها را با دستکش و پنس‌های تمیز بدون دندانه (Blunt) جابه‌جا کنید. همچنین، فقط از بافر مسدودکننده باکیفیت و فیلترشده استفاده کنید تا از نشستن ذرات و آلاینده‌ها روی غشا جلوگیری شود.

تشخیص فلورسانس در نمونه‌های پستانداران دردسرساز است؟

• از مسدودکننده‌های غیرپستاندار مانند سرم ماهی سالمون استفاده کنید تا پس‌زمینه‌ها پایین و نسبت سیگنال به نویز بالا بماند.

سیگنال را نمی‌بینید یا سیگنال در بلات ضعیف است؟

• زمان نوردهی (Exposure time) را افزایش دهید تا سیگنال بهتری به دست آورید.

بلات‌ها را استریپ می‌کنید اما نتیجه دلخواه را نمی‌گیرید؟

• بافرهای استریپینگ سنتی ممکن است فقط برای حذف آنتی‌بادی‌های با میل ترکیبی پایین (Low-affinity) مؤثر باشند و آنتی‌بادی‌های ثانویه دارای برچسب رنگی را بر جای بگذارند که این امر می‌تواند در هنگام پروب کردن مجدد، سیگنال هدف را تحت‌الشعاع قرار دهد. یک بافر استریپینگ انتخاب کنید که مخصوص استفاده در وسترن بلاتینگ فلورسنت باشد.

منبع : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/388439/