چگونه یک طراحی آزمایش بررسی بیان ژن خوب داشته باشیم؟

بررسی بیان ژن ها در دو دهه اخیر اطلاعات بسیار زیادی در زمینه پویایی بیان ژن ها در بافت ها، سلول های مختلف و همچنین شرایط فیزیولوژیک و پاتولوژیک متغیر را برایمان مهیا ساخته است.

در این مقاله به نکات مهم طراحی آزمایش بررسی بیان ژن ها در دو نمونه مختلف خواهیم پرداخت که می تواند اعتبار و دقت داده های بدست آمده شما از بررسی بیان ژن هایتان را بسیار بالا برد.

بررسی بیان ژن چیست؟

بررسی بیان ژن یک واژه کلی است که می تواند به آنالیز بیان شدن برخی ژن ها در سطح پروتئین یا در سطح RNA اشاره داشته باشد. با این اوصاف در تحقیقات زمانی که از اصطلاح بررسی بیان ژن استفاده می شود، منظور بررسی در سطح رونویسی یا همان RNA است. در بررسی بیان در سطح پروتئین از روش هایی مانند الایزا، وسترن بلاتین و سایر روش های سنجش پروتئین استفاده می شود که نیازمند آنتی بادی اختصاصی بر علیه پروتئین مورد نظر شما است.

اما در سنجش بیان ژن ها در سطح رونویسی یا همان RNA شما با استفاده از روش PCR کمی یا همان qPCR اقدام به تکثیر و کمی سازی توالی هدف خود می کنید. اما از آنجایی که نمی توان خود RNA را با PCR تکثیر کرد، در این روش ابتدا RNA مورد نظر به نوعی DNA به نام DNA مکمل یا cDNA تبدیل می شود.

مراحل اصلی بررسی بیان ژن ها در سطح RNA با استفاده از تکنیک qPCR

همانگونه که گفته شد، با استفاده از روش qPCR می توان هر DNAیی را تکثیر کرد. اما برای تکثیر RNA با استفاده از PCR چالش بزرگی وجود دارد. بنابراین ابتدا نیاز است RNA در طی یک تستی به نام سنتز cDNA یا واکنش رونویسی معکوس (Reverse Transcription) به یک نوع DNA به نام DNA مکمل یا cDNA تبدیل شود.  زمانی که qPCR برای کمی سازی یک RNA استفاده می شود به تست آن qRT-PCR گفته می شود. دقیقا همان تستی که برای تشخیص ویروس کوید با استفاده از PCR، استفاده می شود.

مراحل اصلی بررسی بیان ژن ها در کشت سلول:

1. کشت سلول و انجام تیمار یا مداخله مورد نظر

   

2. استخراج RNA         
3. سنجش کمی و کیفی RNA استخراج شده.
4. تبدیل RNA مورد نظر به cDNA با استفاده از پرایمرهای، الیگو dT، رندوم هگزامر، Stem-loop یا پرایمرهای اختصاصی.
5. انجام واکنش qPCR
6. آنالیز داده ها به روش نسبی با استفاده از فرمول لیواک یا فافل.

هر کدام از این مراحلی که در بخش قبل ذکر شده است نیازمند ملاحظات بسیاری است تا داده ی نهایی از اعتبار و دقت کافی برخوردار باشد. از این جهت در بخش بعد به توضیح نکات و ملاحظات بسیار مهم خواهیم پرداخت. اگر چه PCR روشی است که در بسیاری از موارد به شما یک نتیجه خواهد داد اما مشکلی اصلی در این تست اعتبار پایین، عدم تکرارپذیری نتایج می باشد. 

با رعایت نکات بخش بعد اعتبار نتایج شما بهبود پیدا خواهد کرد.

مقالات زیر نیز برای شما مفید است :

بیوانفورماتیک چیست ؟ نقشه راه

PCR چیست؟ فرآیند انجام و کاربردها

نکات مهم طراحی آزمایش بررسی بیان ژن ها:

1. نمونه های سلولی خود را در 3 تکرار کشت کنید. به این نوع تکرار تکرار بیولوژیک گفته می شود.
2. تکرار های بیوولوژیک را به صورت مستقل تا آخرین مرحله یعنی qPCR جلو ببرید.
3. از کیت ها و روش های استخراج RNA با کیفیت استفاده کنید. روش ها و موادی که اکنون در بازار هستند متوع و از تولید کنندگان مختلفی هستند. از کیتی استفاده کنید که تکرار پذیر باشد و نتایج مختلفی برای نمونه ها به شما ندهد. (در این زمینه می توانید به بروشور کیت استخراج RNA ستونی نورکس پلاس مراجعه کنید).
4. مراقب آلودگی های متفاوت و نرخ جذب متفاوت در RNAهای استخراج شده از نمونه ها باشید. اگر نمونه ای حاوی آلودگی باشد و نمونه ای آلودگی نداشته باشد، مقایسه کمی این دو نمونه اعتبار داده های شما را پایین خواهد آورد. چرا که تکثیر نمونه اول تحت تاثیر آلودگی خواهد گرفت.
5. به مقدار کافی RNA برای سنتز cDNA استفاده کنید. برخی ژن ها بیان شان در سطح رونویسی پایین است و به اصطلاح به آن ها low copy می گویند. برای تکثیر و کمی سازی معتبر این نوع ژن ها باید مقدار RNA بالایی استفاده کنید. در صورت نیاز می توانید از سنتز cDNA با پرایمر های اختصاصی استفاده کنید.
6. از کیت سنتز cDNA با دمای فعالیت بالا استفاده کنید. این کیت ها از کیت هایی که از دمای پایین سنتز استفاده میکنند، کیفیت سنتز و طول سنتز بهتری دارند. (برای اطلاعات بیشتر در رابطه با سنتز cDNA می توانید به بروشور و کاتالوگ کیت سنتز cDNA نوت اسکریپت مراجعه کنید).
7. از آنزیم هات استارت در qPCR خود استفاده کنید.
8. حداقل 2 تکرار در qPCR در نظر بگیرید.
9. یک یا چند ژن رفرنس برای نرمالیزاسیون انتخاب کنید. برای انتخاب می توانید از Reference gene validation test استفاده کنید.
10. برای یک نمونه تمامی ژن ها را به همراه ژن (های) رفرنس در یک ران و آماده سازی واکنش تکثیر کنید.
11. از تست Primer efficiency برای یافتن کارایی پرایمر ها استفاده کنید.
12. روش و حجم PCR را برای همه نمونه ها یکسان در نظر بگیرید و آن را در طی روند تست تغییر ندهید.
13. مستر میکس خود را برای همه نمونه ها از یک برند انتخاب کنید (برای اطلاعات بیشتر می توانید به بروشور مستر میکس RealtiQ مراجعه کنید).
14. حتما آنالیز ذوب را برای همه واکنش ها انجام دهید و آن هایی که منحنی ذوب مناسبی ندارند را برای آنالیز استفاده نکنید.
15. از فرمول Pfaffl برای کمی سازی نسبی استفاده کنید.

سخن آخر.

تست بررسی بیان ژن ها با اینکه اطلاعات بسیار مفیدی در اختیار ما می گذارد، اما اگر طبق استاندارد و اصول تکنیکال انجام نگیرد، داده های ما فاقد اعتبار و ارزش علمی خواهد بود. با استفاده از موراد ذکر شده می توانید با اطمینان داده های حاصل از بررسی بیان ژن خود را در یک مجله معتبر به چاپ برسانید.

ما کنار شما هستیم

اگر بر روی بررسی بیان ژن ها پژوهش انجام میدهید، گروه نوترکیب با بهره گیری از متخصصین و روش های ستاپ شده خود می تواند در هر یک از مراحل بالا در کنار شما برای بهبود داده های شما باشد.

 ​