استخراج RNA انواع و روش ها

استخراج RNA یکی از مهم‌ترین تکنیک‌ها در بیولوژی مولکولی است که برای مطالعه ژن‌ها و عملکردهای آن‌ها ضروری است. با توجه به کاربردهای گسترده این تکنیک در تحقیقات ژنتیک، بیوتکنولوژی، و پزشکی، درک اصول و مراحل آن برای متخصصان آزمایشگاهی از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. در این مقاله، به بررسی گام‌به‌گام فرآیند استخراج و خالص‌سازی RNA می‌پردازیم و نکات کاربردی برای دستیابی به نتایج بهینه را ارائه می‌دهیم.

خلوص و یکپارچگی (Integrity) RNA استخراج شده، برای تمامی کاربردهای پایین‌دستی از اهمیت اساسی برخوردار است. این کاربردها شامل تکنیک‌های پرکاربردی مانند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با رونویسی معکوس (RT-PCR/RT-qPCR)، توالی‌یابی RNA (RNA-Seq) برای تحلیل کامل ترانسکریپتوم، و آنالیز میکروآرایه‌ها هستند.

درک دقیق جزئیات جداسازی RNA بسیار مهم است، چرا که RNA ذاتاً مولکولی ناپایدار بوده و به سرعت مستعد تخریب است. دستیابی به یک ایزولاسیون موفقیت‌آمیز، نیازمند رسیدگی دقیق به نمونه‌ها، استفاده از پروتکل‌های بهینه‌سازی شده و انتخاب درست معرف‌ها و تجهیزات برای غلبه بر این چالش‌ها است.علاوه بر این، طبیعت متنوع نمونه‌های بیولوژیکی – که از نمونه‌های میکروبی گرفته تا بافت‌های حفظ‌شده (مانند FFPE) را شامل می‌شود – ایجاب می‌کند که ملاحظات تخصصی برای هر منبع نمونه یا هر کاربرد پایین‌دستی در نظر گرفته شود.

تکنیک استخراج RNA: راهنمای جامع برای متخصصان آزمایشگاهی

کوروش: سلام دکترجعفری، داشتم روی آزمایش‌های استخراج RNA کار می‌کردم و متوجه شدم که برخی نمونه‌ها چقدر می‌توانند مشکل‌ساز باشند. می‌توانید به من کمک کنید تا چالش‌های رایج در استخراج RNA و نحوه مقابله با آن‌ها را بهتر درک کنم؟

دکترجعفری: البته، مارک. استخراج RNA می‌تواند چالش‌برانگیز باشد زیرا RNA بسیار ناپایدار است و به آسانی تخریب می‌شود. انواع مختلف نمونه‌ها، مانند بافت‌ها، خون یا گیاهان، موانع منحصر به فرد خود را اضافه می‌کنند. بیایید این چالش‌ها و راهکارهای غلبه بر آن‌ها را با هم مرور کنیم!

استخراج RNA چیست؟

RNA (ریبونوکلئیک اسید) یکی از مولکول‌های کلیدی در انتقال اطلاعات ژنتیکی و تنظیم بیان ژن‌ها است. تکنیک استخراج RNA فرآیندی است که برای جداسازی RNA از سلول‌ها و بافت‌ها به کار می‌رود. این فرآیند پایه بسیاری از تکنیک‌های پیشرفته مانند RT-PCR، RNA-Seq و microarray است.

چرا استخراج و خالص‌سازی RNA مهم است؟

ایزولاسیون RNA برای درک فرآیندهای سلولی و مکانیسم‌های بیماری یک فرآیند بنیادین است. این امکان را به محققان می‌دهد تا:

• الگوهای بیان ژن را تحلیل کنند، که بینشی در مورد نحوه تنظیم ژن‌ها در شرایط مختلف فراهم می‌کند.
• ابزارهای تشخیص بیماری‌ها مانند سرطان، بیماری‌های عفونی و اختلالات ژنتیکی را از طریق تشخیص مارکرهای خاص RNA توسعه دهند.
• اثرات درمان‌ها، تغییرات محیطی یا جهش‌ها بر تنظیم ژن را مطالعه کنند، که به توسعه دارو و پزشکی دقیق کمک می‌کند.
• به پیشرفت حوزه‌هایی مانند ترانسکریپتومیکس یاری رساند، که مطالعات جامع مولکول‌های RNA در انواع سلول‌ها و بافت‌ها را ممکن می‌سازد.
• توسعه درمان‌های مبتنی بر RNA، از جمله واکسن‌های mRNA و رویکردهای خاموش‌سازی ژن، را تسهیل کنند.

RNA با کیفیت بالا پیش‌نیازی برای نتایج قابل اعتماد در تمام این کاربردها است و این امر، جداسازی RNA را به سنگ بنای بیوتکنولوژی و تحقیقات مولکولی مدرن تبدیل می‌کند.

اهداف استخراج RNA

• تحقیقات گسترده برو روی بیان ژن‌ها
• تحقیقات برای فهم مکانیسم بسیاری از بیماری ها
• توسعه بیومارکر برای تشخیص بیماری ها
• تولید دارو و پروتئین های نوترکیب

انواع RNA که در آزمایش‌ها استخراج می‌شوند.

• mRNA (RNA پیام‌رسان): برای مطالعه بیان ژن.
• rRNA (RNA ریبوزومی): برای بررسی عملکرد ریبوزوم‌ها.
• tRNA (RNA انتقال‌دهنده): مرتبط با انتقال آمینواسیدها. چرا RNA استخراج میکنیم ؟
• miRNA or microRNA or miR
• LncRNA or Long non_coding RNA
• cfRNA
• ExoRNA or EV_RNA
• Total RNA
  

استخراج RNA از کجا انجام می‌گیرد؟

1.سلول های کشت شده در محیط کشت (جانوری،باکتریایی،قارچی،گیاهی) 2.بافت های جداشده از بدن (بافت توموری درمقابل بافت سالم، بافت ملتهب، بافت ترمیم شده)

3.نمونه خون کامل 4.سرم 5.پلاسما 6.ادرار ، مایع CSF ،مایعات جنسی ، ترشحات عفونی، اشک ، بزاق و… اگزوزوم ها یا وزیکولهای خارج سلولی

انواع روش‌های استخراج RNA :

• استخراج فنل/کلروفرم: یک روش استخراج است که از حلال‌های آلی برای جداسازی RNA بر اساس انحلال‌پذیری متفاوت اجزای سلولی استفاده می‌کند.توجه: روش‌های مبتنی بر فنل در گذشته به طور گسترده‌ای برای ایزولاسیون RNA استفاده می‌شدند، اما امروزه به دلیل سمیت برای انسان و محیط زیست کمتر مورد توجه قرار می‌گیرند. در حال حاضر، جایگزین‌های ایمن‌تر و کارآمدتری برای جداسازی RNA در دسترس هستند.
• روش مبتنی بر ستون (Column-based Method)روش ستونی و اتصال به سیلیکا
  (Silica matrices): شامل استفاده از غشاهای سیلیکا یا فیلترها در یک ستون سانتریفیوژ برای اتصال انتخابی و الوشن RNA است.
• روش مگنتیک (Magnetic Bead-based Method): از ذرات مغناطیسی پوشیده شده با سطوح متصل‌شونده به RNA استفاده می‌کند تا RNA به راحتی از محلول جدا شود.
• ایزولاسیون خودکار RNA (Automated RNA Isolation): دستگاه‌هایی مانند EZ2 Connect مراحل اتصال، شستشو و الوشن را به صورت خودکار انجام می‌دهند و سازگاری و مقیاس‌پذیری را در فرآیند استخراج RNA تضمین می‌کنند.

نتخاب روش مناسب برای استخراج RNA در دستیابی به نتایج با کیفیت بالا حیاتی است. جدول زیر، مقایسه‌ای سریع از روش‌های رایج بر اساس فاکتورهای کلیدی ارائه می‌دهد:

* نشان‌دهنده مقیاس‌پذیری برای توان عملیاتی است.

** نشان‌دهنده هزینه پایین به ازای هر نمونه (به طور میانگین) است.

*** نشان‌دهنده احتمال وجود نمک‌های اضافی در RNA است که ممکن است به خالص‌سازی بیشتر نیاز داشته باشد.

مراحل اصلی استخراج RNA

ایزولاسیون RNA معمولاً شامل چندین مرحله کلیدی است:

۱. آماده‌سازی نمونه

• تثبیت RNA: شامل اقداماتی است که از تخریب RNA جلوگیری می‌کند، مانند استفاده از بازدارنده‌های RNase یا عوامل تثبیت‌کننده. نمونه‌های بافتی یا سلولی باید تازه باشند یا با استفاده از مواد نگهدارنده مانند RNAlater تثبیت شوند.
• برای به حداقل رساندن تجزیه RNA، از دمای پایین (مانند نیتروژن مایع) استفاده کنید.

۲. لیز سلولی

لیز سلولی (تخریب سلول): که به آن «تخریب بافت» نیز گفته می‌شود. در این مرحله، سلول‌ها باز شده یا بافت‌ها تجزیه می‌شوند تا RNA رها شود. این کار با روش‌های شیمیایی، مکانیکی یا آنزیمی، بسته به نوع نمونه و کاربرد نهایی، انجام می‌شود. استفاده از بافرهای تخریبی برای شکستن غشاهای سلولی و آزادسازی RNA. در این مرحله، آنزیم‌های RNase باید غیر فعال شوند تا از تخریب RNA جلوگیری شود.

۳. جداسازی RNA

شامل فرآیندهایی است که RNA را از سایر بیومولکول‌ها مانند DNA، پروتئین‌ها و سایر اجزای سلولی تفکیک می‌کند. یک روش رایج، استخراج فنل-کلروفرم (روش Trizol) و روش دیگری روش‌های ستونی( کیت‌های خالص‌سازی تجاری) است که RNA را به فاز آبی منتقل کرده و آن را از DNA و پروتئین‌ها جدا می‌سازد.

۴. خالص‌سازی RNA

برای حذف آلودگی‌های DNA و پروتئین‌ها، از آنزیم DNase و روش‌های خالص‌سازی بیشتر استفاده می‌شود.: شامل حذف آلاینده‌ها مانند نمک‌ها (مشتقات معرف‌های مختلف استخراج RNA) است تا RNA با کیفیت بالا به دست آید. روش‌های معمول شامل مراحل شستشوی اضافی با اتانول ۷۰% یا بافرها است تا ناخالصی‌ها در تکنیک‌های مبتنی بر جداسازی فاز حذف شوند.

الوشن یا تعلیق مجدد

معمولاً مرحله نهایی فرآیند ایزولاسیون است که شامل الوشن (جدا کردن) یا تعلیق مجدد RNA برای بازیابی آن به شکل قابل استفاده است. الوشن معمولاً با استفاده از بافری با غلظت نمک پایین یا آب عاری از نوکلئاز انجام می‌شود که به RNA اجازه می‌دهد بازیابی شده و در محلول حل شود. در مقابل، تعلیق مجدد معمولاً با رسوب‌دهی RNA در حضور نمک شروع می‌شود که به تغلیظ RNA استخراج‌شده نیز کمک می‌کند. پس از شستشو و خشک کردن، RNA با حل شدن در یک بافر مناسب (مانانند بافر TE یا آب) بازسازی می‌شود.

کاربردهای استخراج RNA

• تحلیل بیان ژن: با تکنیک‌هایی مانند RT-qPCR و RNA-Seq.
• توسعه دارو: بررسی اثرات داروها بر بیان ژن‌ها.
• تشخیص بیماری‌ها: استفاده از RNA به‌عنوان بیومارکر برای تشخیص بیماری‌های مختلف مانند سرطان.

استخراج RNA از منابع نمونه مختلف

استخراج RNA از منابع متنوع، نیازمند درک چالش‌ها و پیچیدگی‌های هر نمونه است. درک این موارد برای انتخاب پروتکل صحیح استخراج ضروری است:

غلبه بر مشکلات رایج در استخراج RNA

چالش‌های ایزولاسیون RNA مانند آلودگی DNA ژنومی، بازده پایین یا RNA تخریب شده، می‌توانند به شدت نتایج کاربردهای پایین‌دستی مانند RT-PCR یا RNA-Seq را تحت تأثیر قرار دهند. شناسایی چالش‌ها و تنظیم پروتکل حیاتی است:

چالش‌های رایج در استخراج RNA

1. تجزیه RNA: RNA مولکولی ناپایدار است و به سرعت توسط RNaseها تخریب می‌شود.
2. آلودگی با DNA: حضور DNA در نمونه می‌تواند نتایج را مخدوش کند.
3. کیفیت پایین نمونه‌ها: استفاده از نمونه‌های کهنه یا آلوده می‌تواند بازده را کاهش دهد.

نکات کاربردی برای غلبه بر این چالش‌ها

• همیشه از ابزار و محیط‌های تمیز استفاده کنید.
• مواد مصرفی مخصوص RNA (RNase-free) تهیه کنید.
• از RNase Inhibitorها استفاده کنید.

سوالات متداول درباره تکنیک استخراج RNA

منابع : qiagen , sciencedirect