کیت M T T

مراحل کار:

الف) آماده سازی و حل کردن نمک MTT با غلظت x10

در شرایط استریل و زیر هود لامینار، مقدر 1 میلی لیتر از PBS بر روی ویال حاوی 5 میلی گرم نمک MTT بریزید. شرایط استریل را هم برای MTT Salt و هم PBS رعایت کنید. با وورتکس کردن یا پیپتاژ کردن نمک را کاملا در محلول حل کنید. اگر تکه های حل نشده باقی می ماند، یک بار محلول را فیلتر نمایید. این محلول به شما غلظت 10 برابر را فراهم می آورد که به آن محلول استوک گفته می شود.

ب) ساخت محلول کاری

محلول کاری را به مقدار مورد نیازتان قبل از انجام تست MTT بسازید. اگر شما 10 چاهک پلیت را قرار است مورد آزمایش قرار دهید، نیازمند 1000 میکرولیتر (به اندزه ده تا 100 میکرولیتر) محلول کاری هستید. برای ساخت محلول کاری با هر مقدار کافیست یک دهم هجم کل از محلول 10x استوک MTT بریزید و توسط PBS به حجم نهایی برسانید. برای محلول کاری 1 میلی لیتری شما نیاز به 100 میکرولیتر محلول استوک MTT و 900 میکرولیتر محلول PBS خواهید داشت.

نکته: توصیه می شود به اندازه یک تست محلول کاری بیشتری بسازید تا اطمینان حاصل کنید که اگر خطای پایپتینگ داشتید محلول کاری تان کم نخواهد بود.

ج) مراحل انجام کار

• بعد از کشت سلول و رسیدن زمان بررسی زنده مانی سلولی با نمک MTT، محیط کشت رویی سلول ها را خارج کنید.

نکته: سعی کنید محیط کشت را کامل از همه چاهک ها خارج کنید. خارج کردن تمامی محیط کشت به تکرار پذیر بودن تست شما کمک خواهد کرد.

• 100 میکرولیتر از محلول کاری MTT که تازه ساخته اید را درون هر یک از چاهک ها بریزید.
• درب پلیت را بگزارید و دور آن را فویل بپیچید.
• به مدت 3-4 ساعت پلیت را در شرایط کشت سلولی خود قرار دهید.
• پلیت را بردارید و محلول MTT را از روی سلول ها کاملا خارج کنید.

نکته 2: خارج کردن کامل محلول به تکرار پذیر شدن تست شما کمک خواهد کرد.

نکته 3: در این مرحله شما کریستال های فورمازان به رنگ بنفش را خواهید دید.

• داخل هر چاهک 100 میکرولیتر از حلال فورمازان که در باتل Solvent قرار دارد بریزید.
• درب پلیت را بگزارید و دور آن فویل بپیچید. به مدت 15-10 دقیقه بر روی شیکر با دور بسیار آرام بگزارید تا کریستال های فورمازان کامل حل شود.

نکته 4: بعد از حل شدن کریستال های فورمازان بلافاصله خوانش را انجام دهید. شما حداکثر 20-30 دقیقه زمان دارید تا خوانش را انام دهید. هرچه خوانش زود تر انجم شود تست شما معتبر تر خواهد بود.

• جذب را در طول موج 570 برای هر یک از چاهک ها بخوانید. می توانید برای حذف جذب بک گراند جذب 630 را نیز خوانده و آن را از مقدار جذب 570 کم کنید.

د) آنالیز نتایج

– بررسی میزان زنده مانی

1) حداقل دو تکرار برای هر تست در نظر بگیرید. میانگین آن ها را حساب کنید و جذب بک گراند را از آن ها کم کنید. داده حاصل جذب تصحیح شده نام دارد.

3) میزان جذب اندازه گیری شد با مقدار سلول رابطه مستقیمی دارد.

-بررسی سمیت سلولی

1) حداقل دو تکرار برای هر تست در نظر بگیرید. میانگین آن ها را حساب کنید و جذب بک گراند را از آن ها کم کنید. داده حاصل جذب تصحیح شده نام دارد.

2) درصد سمیت سلولی را با استفاده از گروه کنترل که با همان شرایط سلول های تیمار شده کشت شده و در تست MTT استفاده شده حساب کنید. فرمول محاسله به شرح زیر است:

%Cytotoxicity= 100 (Control-Sample)

دانلود کاتالوگ محصول کیت M T T