الکتروفورز(Electrophoresis) یکی ازمتداول ترین تکنیک آزمایشگاهی برای جداسازی، شناسایی، تجزیه و تحلیل و در برخی موارد خالص سازی و تشخیص مولکول ها (پروتئین ها،DNAوRNA یا سایر مولکول های باردار ) بر اساس اندازه و بار الکتریکی میباشد که با دارا بودن ویژگی هایی از قبیل قابلیت تفکیک زمانی و مکانی مراحل آنالیز ،آسان بودن روش انجام کار و مقرون به صرفه بودن اطلاعات ارزشمندی به ما می دهد.
اهمیت تکنیک الکتروفورز در علوم زیستی و شیمی:
1.الکتروفورز ابزاری کلیدی برای مطالعه RNA، DNA و پروتئین ها است، به ویژه در تجزیه و تحلیل ژنوم، پروتئومیکس و تشخیص بیماری ها و…
2.امکان جداسازی مولکول ها با تفاوت های جزئی در اندازه یا بار را فراهم می کند.
3. به شناسایی جهش های ژنتیکی، تعیین توالی DNA وبه ویژه بررسی ساختارهای پروتئین ها (به این دلیل که پروتئین های جهش یافته،اغلب بلندتر یا کوتاه تر از مولکول طبیعی هستند و بنابراین در ژل الکتروفورز جایگاه متفاوتی دارند) کمک می کند.
4. این تکنیک در تشخیص بسیاری ازبیماری های زمینه ای درپزشکی، ناهنجاری و بررسی پرونده های پزشکی قانونی مورد استفاده قرار میگیرد.
تاریخچه توسعه تکنیک الکتروفورز:
درقرن نوزده میلادی مفهوم ذرات باردار در میدان الکتریکی برای اولین بار توسط شیمیدان روس به اسم فردیناند فردریک رویس در طی آزمایش هایی با خاک رس مشاهده شد او دریافت که ذرات خاک رس تحت تاثیر جریان الکتریکی به سمت الکترود های مخالف حرکت می کنند در واقع این پدیده به عنوان پایه تئوریک الکتروفورز شناخته می شود. سپس مطالعات بیشتری در مورد حرکت ذرات باردار در مایعات توسط دانشمندانی مانند ویلهلم هیتورف انجام شد که به درک بهتر رفتار یون ها در میدان الکتریکی کمک کرد.
دراوایل قرن بیستم میلادی آرنه تیسلیوس شیمیدان سوئدی دستگاهی به نام الکتروفورز تیسلیوس را طراحی کرد که برای جداسازی پروتئین های سرم خون (مانند آلبومین و گلبولین ها) استفاده میشد این دستگاه از یک لوله Uشکل پر از محلول بافر استفاده میکرد واین کار امکان جداسازی مولکول ها بر اساس بار الکتریکی و تحرک آن ها را فراهم می کرد که درنهایت برنده جایزه نوبل شیمی شد. معرفی ژل الکتروفورز تحولی عظیم در این تکنیک ایجاد کرد که از این ژل (مانند آگارز و پلی آکریل آمید) به عنوان محیطی برای جداسازی دقیق مولکول ها کاربرد داشت.
الیور اسمیتز تکینک ژل نشاسته الکتروفورز رامعرفی کرد که برای جداسازی پروتئین ها بسیار موثر بود این روش دقت بالایی در جداسازی پروتئین های پیچیده به شدت مورد استقبال قرار گرفت.
در ادامه، توسعه ژل پلیآکریلآمید (PAGE )توسط محققانی مانند ریموند و شاپیرو، دقت جداسازی پروتئینها را به سطح جدیدی رساند، زیرا این ژلها منافذ کوچکتری نسبت به آگارز داشتند و برای مولکولهای کوچکتر مناسب بودند. نقطه عطف بعدی، ابداع SDS-PAGE توسط اولریش لملی بود که با استفاده از سدیم دودسیل سولفات ((SDS برای دناتوره کردن پروتئینها و دادن بار منفی یکنواخت، جداسازی پروتئینها را صرفاً بر اساس وزن مولکولی ممکن ساخت. این روش به استاندارد طلایی در تحلیل پروتئینها تبدیل شد.
با پیشرفت علم، تکنیکهای پیچیدهتری مانند الکتروفورز دوبعدی (2D-PAGE) توسعه یافت که پروتئینها را بر اساس نقطه ایزوالکتریک و وزن مولکولی جدا میکرد و برای مطالعات پروتئومیکس بسیار ارزشمند شد. همچنین، الکتروفورز مویرگی با ارائه دقت بالاتر و امکان اتوماسیون، در آنالیزهای مولکولی و پزشکی قانونی کاربرد یافت.
کاربردهای کلی الکتروفورز در تشخیص پزشکی و صنایع غذایی:
الکتروفورز در صنایع غذایی کاربرد های گوناگونی دارند چند کاربرد آن را مثال میزنیم.
پروتئن های شیر گاو، گوسفند و.. را به کمک SDS_PAGEجدا کرده و تشخیص میدهند آیا شیر تقلبی بوده یا خیر
با تشخیص پروتئن های سویا متوجه می شنوند که آیا دز گوشت تقلبی صورت گرفته یا خیر
در تشخیص آلودگی میکروبی در مواد غذایی بطور مثال وجود سم( توکنسین) باکتری در مواد غذایی
جداسازی رنگ مصنوعی ، نگهدارنده ها و شیرین کننده ها
بررسی فعالیت های آنزیم های صنعتی مثل پروتئاز در پنیر سازی و…
در بلاگ نوترکیب بیشتر بخوانید:
الکتروفورز در پزشکی:
در تشخیص آنتی بادی های غیر طبیعی بدن
شناسایی سم( توکسین) در بدن
تشخیص جرم در پزشکی قانونی
پیوند اعضا
و…
انواع الکتروفورز:
الکتروفورز ژل آگارز
کاربرد این تکنیک جداسازی قطعات DNA, RNA بر اساس اندازه می باشد در تحلیل PCR، بررسی محدودیت آنزیمی و کلونینگ نیز میتوان استفاده کرد از رنگ های فلورسنت مانند اتیدیوم بروماید یاSYBR برای مشاهده مولکول ها استفاده می شود از مزایای آن میتونه به ساده، ارزان و مناسب برای تجزیه و تحلیل DNA ,RNA نام برد و از معایب آن به رزولوشن پایین برای قطعات کوچک یا پروتئین ها میتوان یاد کرد.
الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید
کاربرد آن جداسازی پروتئن ها، پپتیدها یا قطعات کوچک DNA( مانند توالی یابی ) استفاده کرد از ویژگی های آن به رزولوشن بالا برای جداسازی مولکول های کوچک میتوان نام برد.
در واقع این روش در دو نوع اصلی انجام میشود:
با استفاده از سدیم دودسیل برای دناتوره کردن پروتئین ها و SDS سولفات و جداسازی بر اساس وزن مولکولی و دیگری بدون دناتوراسیون، برای حفظ ساختار طبیعی پروتئن ها که برای توالی یابی DNA یا تحلیل پروتئن ها استفاده می شود. از مزایای آن دقت بالا در جداسازی مولکول های کوچک و از معایب آن میتوان به آماده سازی پیچیده تر و زمان بیشتر از آگارز میتوان نام برد.
الکتروفورز دو بعدی
کاربرد آن جداسازی پیچیده پروتئین ها بر اساس دو ویژگی : نقطه ایزوالکتریکpl)و وزن مولکولی)و مراحل استفاده از آن
مرحله اول: جداسازی بر اساس نقطه ایزوالکتریک pl) در یک گرادیان PH.)
مرحله دوم: جداسازی بر اساس وزن مولکولی با SDS_PAGE
برای تحلیل پروتئوم و شناسایی پروتئن های پیچیده نیز استفاده می شود. از مزایای آن به قابلیت جداسازی هزاران پروتئین در یک آزمایش و از معایب آن نیاز به تجهیزات پیشرفته و زمان بر بودن نامید.
الکتروفورز مویرگی
از آن با جداسازی DNA پروتئن ها یا یون های کوچک در مقیاس میکرو استفاده میشود و از مزایای آن به رزولوشن و سرعت بسیار بالا . حجم نمونه کم و توالی یابی DNA وانالیز مواد دارویی و تشخیص پزشکی میتوان یاد کرد از مزایای دیگر آن حساسیت بالا و اتوماسیون آسان بوده و معایب آن هزینه بالای تجهیزات می باشد
الکتروفورز ایزوالکتریک فوکوسینگ
از کاربرد آن جداسازی پروتئن بر اساس نقطه ایزوالکتریک یاد می کنند . پروتئین ها تا زمانی که به PH برابر pl خود برسند مهاجرت می کنند و در آن نقطه متوقف می شوند. و اغلب به عنوان مرحله اول در الکتروفوزر دو بعدی استفاده میشود از مزایای آن دقت بالا در جداسازی پروتئن ها و از معایب آن محدود بودن به پروتئین ها و نیاز به تجهیزات خاص نامید.
الکتروفورز پالس فیلد
کاربرد آن جداسازی قطعات بسیار بزرگDNA تا چند مگاباز و از ویژگی ها آن میتوان برای نقشه برداری ژنوم باکتری ها یا تجزیه و تحلیل کروموزم های بزرگ استفاده می شود. میدان الکتریکی به صورت متناوت تغییر جهت می دهد تا مولکول های بزرگ جابجا شوند از مزایا میتوان به جداسازی DNA های بزرگ و از معایب میتوان به زمان بر بودن یعنی چندین ساعت تا چندین روز نام برد.
الکتروفورز کاغذی
از کاربرد آن میتوان جداسازی مولکول های کوچک مانند اسید هایی آمینه یا پپتید ها نام برد و از ویژگی آن تجزیه و تحلیل مواد در آزمایش های اولیه یاد کرد و از مزایای آن ساده و ارزان بودن و ازمعایب رزولوشن پایین و کاربرد محدود میتوان نام برد.
الکتروفورز دیسک
از کاربرد آن جداسازی پروتئین ها با رزولوشن بالا و از ویژگی آن از سیستم های بافر ناپیوسته برای افزایش وضوح جداسازی استفاده شود از مزایای آن دقت بالا و از معایبش پیچیدگی در آمادگی نام برد
مواد و تجهیزات مورد نیاز برای تکنینک های الکتروفورز:
تجهیزات مورد تیاز بسته به نوع تکنیک متفاوت است، اما برخی تجهیزات مانند منبع تغذیه، بافرها و مواد رنگ آمیزی در اغلب آن ها مشترک هستند.
تجهیزات مشترک در اغلب تکنیک ها:
۱.تجهیزات : منبع تغذیه ، محفظه الکتروفورز، الکترودها و کابل ها، دستگاه تصویز برداری یا ترانس ایلومیناتورUV
۲.مواد: بافر های الکتروفورز، رنگ های بارگیری، نشانگر اای مولکولی مواد رنگ آمیزی مانند اتیدیوم بروماید( برای (DNAیا کوماسی بلو( برای پروتئین).
الکتروفورز ژل آگارز:
۱.تجهیزات: سینی ریخته گری ژل،شانه ها،جعبه ژل،منبع تغذیه ، نورUV, ماکروویو(برای ذوب آگاروز)
۲.آگاروز( پودر ژل با غلظت ۰.۵تا ۲% بسته به اندازه قطعه)، بافر TAEیاTBE, اتیدیوم بروماید، رنگ بارگیری( که حاوی گلیسرول و نشانگر های رنگی می باشد) و نردبان
الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید
۱.تجهیزات: سیستم الکتروفورز عمودی، منبع تغذیه، سیتی ریخته گری، دستگاه بلاتینگ
۲. مواد: پلی آکریل آمید و بیس آکریل آمید، SDS (دترجنت برای دناتورا کردن پروتئین ها)، APS و TERMED ، بافر Tris_ Glycine، بتا مرکاپتواتانول ، کوماسی بلو یا نقره ، نردبان پروتئینی
الکتروفورز کاپیلاری:
۱. تجهیزات: دستگاه الکتروفورز کاپیلاری که شامل لوله کاپیلاری می باشد و منبع تغذیه ولتاژ بالا، آشکارساز، سیستم تزریق نمونه
۲.مواد: لوبه کاپیلاری ، بافر های رسانا، آمفولیت ها
فوکوسینگ ایزوالکتریک:
تجهیزات: سیستمIEF، منبع تغذیه ، محفظه ژل
مواد: آمفولیت ها ، ژل آگاروز یا پلی آکریل آمید ، بافر ها، مواد رنگ آمیزی برای پروتئین ها
الکتروفورز دو بعدی:
تجهیزات: سیستم های ترکیبی ، منبع تعذیه، دستگاه تصویر برداری برای نقاط پروتئینی
مواد: نوارهای ژل برای بعد اول، ژل پلی آکریل آمید برای بعد دوم، SDS و مواد دناتوره کننده ، آمفولیت ها، مواد رنگ آمیزی مانند کوماسی بلو
الکتروفورز کاغذی یا سلولز استات( تکنیک قدیمی تر برای پروتئن ها یا لیپو پروتئین ها)
تجهیزات: شامل فیلتر یا غشای سلولز استات، منبع تغذیه کم ولتاژ
مواد: بافرها ، رنگ ها
الکتروفورز پالسد _فیلد:
تجهیزات: منبع تغذیه پالسی ، ژل آگاروز
مواد: بافرها، اتیدیوم بروماید
ایمونو الکتروفورز:
تجهیزات: ژل آگاروز، منبع تغذیه
مواد، آنتی بادی های خاص
آماده سازی نمونه برای الکتروفورز:
آماده سازی نمونه یکی از مراحل کلیدی در تکینک الکتروفورز ها است که بر کیفیت نتایج تاثیر به سزایی دارد مراحل آماده سازی بسته به نوع الکتروفورز و نمونه(, DNA ,RNA پروتئین)متفاوت است در ادامه آماده سازی هر کدام را مورد بررسی قرار می دهیم با ما همراه باشید.
آماده سازی نمونه برای الکتروفورز ژل آگارز(DNA ,RNA):
استخراج نمونه:
از سلول ها یا بافت ها با استفاده از روش های استخراج RNAیا DNAجدا می شود. برای استخراج می توان از کیت های تجاری یا روش های فنل_ کلروفرم بسته به نوع نمونه , منابع موجود و… استفاده کرد.
برای RNA باید از مهارکنننده های Rnase استفاده کرد تا از تخریب جلوگیری شود ولی برای DNA نیازی به مهارکننده نیست مگر اینکه نمونه شما حاوی آلاینده هایی باشد که الکتروفورز را مختل کند
تمیز کردن نمونه:
نمونه ها با روش هایی مانند رسوب دهی با اتانول یا استفاده از ستون های تصفیه پاک سازی می شوند تا آلودگی های نمکی یا پروتئینی حذف شود.
کمی سازی:
غلظت DNA,RNAبا استفاده از اسپکتروفتومتریا فلورومتری اندازه گیری می شود. از این روش استفاده می کنیم تا از بارگذاری بیش از حد یا کم نمونه در ژل الکتروفورز جلوگیری کنیم.
مخلوط کردن با بافر لودینگ:
نمونه با بافر لودینگ مخلوط می شود. نسبت نمونه به بافر لودینگ معمولا 1:5 یا 1.6 می باشد.
دناتوره کردن( در صورت نیاز ):
برایRNA ممکن دناتوراسیون با فرمالدهید یا گرما انجام شود تا سختارهای ثانویه باز شوند.
ذخیره سازی:
نمونه ها در دمای 20- یا 80- درجه سانتی گراد نگهداری می شوند تا از تخریب جلوگیری شود.
آماده سازی نمونه برای الکتروفورز SDS_PAGE (پروتئین ها):
استخراج پروتئین:
پروتئین ها از سلول ها یا بافت ها با استفاده از بافرهای لیز استخراج می شوند. بافرهای لیز حاوی دترجنت هایی مانندSDS و .. هستند.
کمی سازی:
غلظت پروتئین با روش هایی مانند برادفوردBCA ,LOWRY, اندازه گیری می شود.
دناتوراسیون:
نمونه ها با بافر نمونه (حاوی , SDS گلیسرول و رنگ بروموفنول بلو و …) مخلوط شده و در دمای 95الی 100 درجه سانتی گراد به مدت 5الی 10 دقیقه حرارت داده می شود تا دناتور شوند.
سانتریفیروژ:
نمونه ها سانتریفیوژ می شوند تا مواد غیر محلول حذف شونند.
لودینگ:
مقدار مشخصی از پروتئین(معمولا 10 الی 50 میکروگرم) به چاهک ژل اضافه می شود.
مارکر وزن مولکولی DNA Ladder:
مارکر پروتئینی با وزن های مولکولی مشخص در کنار نمونه ها لود می شود.
لدر الکتروفورز ۱۰۰ جفت بازی
570,000 تومان
لدرآماده استفاده (RTU)
حاوی بافر بارگذاری (loading buffer)
حاوی رنگ های ردیاب (tracking dye)
310 در انبار
آماده سازی نمونه برای الکتروفورز دوبعدی:
استخراج پروتئین:
پروتئین ها با بافر های حاوی اوره, تیوره و دترجنت های غیر یونی استخراج می شوندد.
حذف آلودگی ها:
نمک ها لیپیدها و سایر آلاینده ها با روش هایی مانند رسوب دهی حذف می شوند.
کمی سازی:
مشابهSDS-PAGE غلظت پروتئین ها اندازه گیری می شود.
آماده سازی برایIEF:
نمونه ها با بافر ری هیدراسیون مخلوط می شوند. نمونه روی نوار های گرادیان Ph لود شده و برای فوکوسینگ آماده می شوند.
آماده سازی نمونه برای الکتروفورز مویرگی:
فیلتراسیون:
نمونه ها از فیلتر های 22/0 میکرومتری عبور داده می شوند تا ذرات معلق حذف شوند
رقیق سازی:
نمونه ها در بافر مناسب رقیق می شوند(مانند بافرTBE ,TAE)
اضافه کردن شناساگر:
نشانگر های فلورسنت یا داخلی برای شناسایی و کالیبراسیون اضافه می شوند.
لودینگ:
نمونه ها بصورت خودکار یا دستی به داخل لوله مویرگی تزریق می شوند.
پروتکل های اجرایی الکتروفورز:
پروتکل اجرایی آگارز:
ابتدا ژل آگارز ۰/۵ تا ۲ درصد را در بافر مربوطه(TAEیا TBE) بریزد و حل کنید و آن را در قالب بریزید سپس نمونه DNA را به همراه لودینگ را توی چاهک بریزید و سپس ژل رل اوی تانک با بافر قرار بدید
ولتاژ ثابتی به نمونه وارد کنید تا DNA به سمت مثبت حرکت کند
سپس ژل را با اتیدیوم برماید رنگ کنید و در نهاتها زیر نور UV ببینید که باند DNA در کجا قرار دارند.
پروتکل پلی آکریل آمید:
ابتدا محلول اکریل آمید و بیس آن را به همرا APS را در قالب شیشه ای بریزید تا عمل
پلیمراسیون انجام شود سپس نمونه پروتئن یا DNA مورد نظر را به همراه لودینگ بافر را بجوشانید و سپس لود کنید
ژل را بصورت عمودی با بافر رانینگ قرار بدید
ولتاژ را بالا ببرید تا از باند جدا شوند و سپس ژل را با کوماسی بلو یا نقره رنگ کنید.
پروتوکل الکتروفورز دو بعدی:
در مرحله اول ابتدا نمونه پروتئین را با اوره و DTTو آمفولیت مخلوط کنید سپس آن را روی استریپIEF لود کنید سپس ولتاژ بالا(۱۰/۰۰۰) ولت بزنید تا پروتئن به pl برسند.
استریپEIF را روی ژل پلی آکریل امید بذارید و ژل معمولی ران کنید سپس در مرحله آخر ژل را رنگ کنید که در نهایت نقشه دو بعدی پروتئن را به شما میدهد.
پروتکل مویرگی
مویرگ سیلیکا را با آمفولیت پر کنید و سپس نمونه را تزریق کنید و ولتاژ بالا بزنید با اعمال ولتاژ بالا پروتئین ها به pl می رسند و فوکوس می شوند سپس با فشار باند را به دتکتور UV بفرستید.
پروتوکل پالس فیلد:
ابتدا ژل آگارز کم درصدی بسازید سپس باکتری یا قارچ مورد نظر را در پلاگ آگارز گیر بندازید و با لیز آنزیم هضم کنید که با این کار DNA بزرگ آزاد می شود سپس پلاگ را توی چاهک ژل بذارید و ژل را در دستگاه PFGE با بافر سرد شده قرار بدید در نهایت میدان الکتریکی پالسی با ولتاژ پایین بزنید و ژل را رنگ کنید و DNA مگابازی را ببینید.
نکات عملی الکتروفورز:
1. انتخاب بافر: بافرهای رایج برایDNA :
( =(Tris-Acetate-EDTA TAE
Tris-Borate-EDTA) )= TBA
بافر رایج برای پروتئین:
Tris-Glycine
2.ولتاژ و زمان: ولتاژ و زمان الکتروفورز باید بر اساس نوع ژل و اندازه مولکول تنظیم شود برای مثال 1100الی120 ولت برای ژل آگارز
3. رنگ آمیزی و مشاهده:
برایDNA,RNA : اتیدیوم بروماید, SYBR Green یا SafeView .
برای پروتئین ها: کوماسی بلو, نقره یا رنگ های فلورسنت
4. ایمنی:
هنگام کار با رنگ های سرطان زا مانند اتیدیوم بروماید, احتیاط لازم است و حتما از دستکش و کلاه ایمنی استفاده کنید
مشکلات رایج و عیب یابی الکتروفورزها:
عدم مشاهده باند یا باندها ضعیف:
علت این مشکل می توان به غلظت نمونه پایین, تخریب نمونه توسط پروتئاز یا DNase ,رنگ آمیزی ناکافی یا درصد ژل نامناسب بیان کرد.
و برای حل این مشکل میتوان نمونه را با دقت کمی سازی کرد , یا از بازدارنده های آنزیمی EDTA,PMSF)) استفاده کنید. از رنگ حساس تر( نقره و..) استفاده کنید. تنظیم درصد ژل انجام دهید.
باندهای پراکنده یا تحریف شده:
علت این مشکل میتواند بارگذاری بیش از حد. آلودگی نمک یا پروتئین یا ژل ناهمگن باشد
و برای حل این مشکلات حجم نمونه را کاهش دهید. نمونه را خالص سازی کنید و از پلیمریزاسیون یکنواخت ژل اطمینان حاصل کنید.
ژل ناهموار یا شکسته:
علت این مشکل را میتوان پلیمریزاسیون ناقص. دمای بالا یا ژل قدیمی عنوان کرد.که برای حل این مشکل سعی کنید ژل را خنک نگه دارید یا از ژل تازه استفاده کنید.
نویز پس زمینه بالا:
علت این مشکل میتواند رنگ آمیزی بیش از حد یا آلودگی نمونه یا ژل عنوان کرد.
نکات کلی عیب یابی:
تجهیزات: منبع تغذیه, الکترودها و تانک را بررسی و تمیز کنید.
مواد: از بافرها ژل و مواد شیمیایی تازه استفاده کنید.
نمونه : نمونه ها را در یخ نگه دارید و از تخریب جلوگیری کنید.
مارکر: همیشه مارکر وزن مولکولی ( DNA Ladder ) را بارگذاری کنید.
پروتکل: پروتکل را دقیق دنبال کنید و شرایط را بهینه کنید.
نکات ایمنی هنگام کار با آن:
1. از دستکش عایق و کفش ایمنی استفاده کنید. دستگاه را قبل از باز کردن یا تنظیم از برق بکشید, تماس با قطعات مرطوب در حین کار با در هنگام روشن بودن دستگاه خودداری کنید.
2. مواد شیمیایی را در زیر هود شیمیایی جابجا کنید, از دستکش و روپوش آزمایشگاه برای محافظت در برابر مواد شیمیایی مانند اتیدیوم بروماید استفاده کنید.
3.هنگام استفاده از ژل تحت نور UV از شیلد صورت یا عینک مخصوص استفاده کنید
4.ضایعات شیمیایی و ژل حاوی اتیدیوم بروماید را طبق پروتکل های ایمنی دفع کنید.
5.قبل از استفاده از دستگاههاز سالم بودن آن اطمینان حاصل کنید.
پیشرفت ها و آینده الکتروفورز:
الکتروفورز به عنوان یک تکنیک کلیدی در بیوتکنولوژی و علوم زیستی است که در سال های اخیر پیشرفت ها چشمگیری داشته است بر اساس گزارش های بازار و تحقیقات علمی میتوان به ادغام این تکنیک با هوش مصنوعی برای تحلیل خودکار الگوهای ژل. بهبود تشخیص سرطان و کاهش خطرات انسانی و استفاده از بافر های سبز و سیستم کم مصرف در نظر گرفت.
منبع : NCBI
