استخراج RNA به روش فنل-کلروفرم

استخراجRNA فنل-کلروفرم یکی از مراحل اساسی در مطالعات ژنتیکی، بیان ژن، و تحقیقات بیولوژی مولکولی است. روش فنل-کلروفرم که به روش TRIzol نیز شناخته می‌شود، یکی از پرکاربردترین روش‌های استخراج RNA است که دقت و بازده بالایی دارد. در این مقاله، پروتکل استخراج RNA با استفاده از فنل-کلروفرم را به‌صورت جامع بررسی کرده و نکات کلیدی برای بهینه‌سازی این فرایند را ارائه خواهیم کرد.

مواد و تجهیزات موردنیاز استخراجRNA فنل-کلروفرم

مواد شیمیایی

• TRIzol یا مخلوط فنل-کلروفرم (یا مشابه آن مانند RNAzol)
• ایزوپروپانول (ایزوپروپیل الکل)
• اتانول 75٪
• دی‌اتیل‌پیروکربنات (DEPC) برای تیمار آب
• کلروفرم
• محلول TE (Tris-EDTA) یا آب RNase-Free

تجهیزات

• سانتریفیوژ یخچال‌دار
• پیپت و سرسمپلرهای RNase-Free
• یخ خشک یا حمام یخ
• ویال‌های میکروتیوب 1.5 میلی‌لیتری RNase-Free
• هود شیمیایی
• اسپکتروفتومتر (مانند نانودراپ) یا دستگاه الکتروفورز ژل آگارز

پروتکل استخراج RNA به روش فنل-کلروفرم

1. آماده‌سازی نمونه

1. بافت یا سلول‌های موردنظر را در شرایط استریل جمع‌آوری کنید.
2. نمونه‌ها را در نیتروژن مایع یا دمای -80°C نگهداری کنید تا تجزیه RNA رخ ندهد.

2. لیز سلولی

1. 100 میلی‌لیتر TRIzol را به 1×10⁶ سلول یا 50-100 میلی‌گرم بافت اضافه کنید.
2. با پیپت یا ورتکس کاملاً مخلوط کنید تا بافت کاملاً حل شود.
3. نمونه را در دمای اتاق (25°C) به مدت 5 دقیقه انکوبه کنید تا سلول‌ها کاملاً لیز شوند.

3. افزودن کلروفرم

1. به ازای هر 1 میلی‌لیتر TRIzol، 200 میکرولیتر کلروفرم اضافه کنید.
2. لوله‌ها را 15 ثانیه شدیداً ورتکس کنید.
3. به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
4. نمونه‌ها را در 12000 × g به مدت 15 دقیقه در 4°C سانتریفیوژ کنید.

4. جداسازی فاز آبی

• بعد از سانتریفیوژ، سه فاز تشکیل می‌شود:
  • فاز آلی (پایین): حاوی پروتئین‌ها و لیپیدها
  • لایه بینابینی: حاوی DNA
  • فاز آبی (بالا): حاوی RNA

1. فاز آبی را با دقت به لوله جدید منتقل کنید (حدود 60٪ حجم کل محلول).
2. مراقب باشید که لایه بینابینی و فاز آلی وارد نمونه نشود.

5. رسوب‌دهی RNA

1. به هر 1 میلی‌لیتر فاز آبی، 0.5 میلی‌لیتر ایزوپروپانول اضافه کنید و به آرامی مخلوط کنید.
2. نمونه را به مدت 10 دقیقه در دمای -20°C یا 30 دقیقه در یخچال انکوبه کنید.
3. در 12000 × g به مدت 10 دقیقه در 4°C سانتریفیوژ کنید.
4. RNA به صورت یک پلت سفید رنگ در ته لوله ظاهر خواهد شد.

6. شستشو با اتانول

1. 1 میلی‌لیتر اتانول 75٪ (در آب DEPC) به رسوب RNA اضافه کنید.
2. در 7500 × g به مدت 5 دقیقه در 4°C سانتریفیوژ کنید.
3. اتانول را خارج کنید و RNA را در دمای اتاق به مدت 5-10 دقیقه خشک کنید.

7. حل کردن RNA

1. RNA را در 30-50 میکرولیتر آب RNase-Free یا محلول TE حل کنید.
2. نمونه را در دمای 55-60°C به مدت 10 دقیقه انکوبه کنید تا RNA کاملاً حل شود.

ارزیابی کیفیت و کمیت RNA

1. بررسی جذب نوری (اسپکتروفتومتری)

• نسبت A260/A280 را اندازه‌گیری کنید. مقدار بهینه بین 1.8 تا 2.1 است.
• نسبت A260/A230 نیز باید بالای 2.0 باشد.

2. بررسی روی ژل آگارز

1. 1٪ ژل آگارز حاوی اتیدیوم بروماید تهیه کنید.
2. 1-2 میکرولیتر RNA را روی ژل لود کنید.
3. باندهای 28S و 18S rRNA را بررسی کنید. نسبت 2:1 نشان‌دهنده کیفیت خوب RNA است.

نکات کلیدی برای جلوگیری از تخریب RNA

• استفاده از وسایل RNase-Free و پوشیدن دستکش هنگام کار
• تیمار تمام محلول‌ها و آب با DEPC
• نگهداری نمونه‌ها در دمای -80°C برای طولانی‌مدت

نتیجه‌گیری

روش فنل-کلروفرم یکی از کارآمدترین روش‌های استخراج RNA است که با رعایت نکات بهداشتی و کنترل RNase می‌توان RNA باکیفیت و خلوص بالا استخراج کرد. استفاده از این پروتکل در تحقیقات مولکولی مانند RT-PCR و NGS، موجب افزایش دقت و بازدهی آزمایش‌ها خواهد شد.

اگر شما هم تجربه‌ای در استخراج RNA دارید، نظرات خود را در بخش کامنت‌ها با ما به اشتراک بگذارید! 🚀

📌 سایر مقالات پیشنهادی:

• راهنمای کامل PCR و اصول بهینه‌سازی آن
• روش‌های پیشرفته استخراج DNA و مقایسه آن‌ها
• نحوه جلوگیری از آلودگی RNase در آزمایشگاه

📝 منتظر نظرات و سوالات شما هستیم!

منبع : NCBI